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公司新闻/正文
最新 CAR-T 表达阳性率检测案例解析
5591 人阅读发布时间：2017-12-15 13:39
今年两款重磅 CAR-T 疗法，即诺华公司用于治疗 25 岁以下青少年难治或复发 B 细胞急性淋巴白血病的 Kymriah 和 Kite Pharma 公司用于治疗特殊类型成人大 B 细胞淋巴瘤的 Yescarta，相继获美国 FDA 批准上市，让 CAR-T 细胞疗法产业化前景更加光明，也使得越来越多的企业纷纷布局这个领域，根据 ClinicalTrials 的数据， 目前全球 CAR-T 临床研究项目已超过 400 个。
CAR-T 细胞作为一种「活的药物」，其制备流程复杂，质控环节众多。CAR-T 表达阳性率的检测作为 CAR-T 疗法质量控制的重要一环，目前尚无标准的检测方案。据了解，企业内部常用的检测方案有利用 Protein L、Anti-Fab 抗体或靶点蛋白结合流式细胞术进行检测，其中靶点蛋白结合流式细胞术的检测方案因其特异性强的优势而备受业界人士的青睐。在法规尚不完全明朗的今天，很多业内人士预期靶点特异性的检测将会被 CFDA 纳入 CAR-T 质量控制监管考量的范畴。今天小编为大家带来的正是利用靶点蛋白结合流式细胞技术检测 CAR-T 表达阳性率的真实案例解析，以供大家参考。
案例一：anti-BCMA CAR 表达阳性率检测
检测数据由深圳普瑞金生物药业公司友情提供！非常感谢！
检测方法：流式细胞术
检测仪器：BD FACSCalibur 流式细胞分析仪
样本信息：转染 anti-BCMA CAR 的人原代 T 淋巴细胞
主要试剂：
生物素标记的 BCMA 蛋白 (Biotinylated Human BCMA / TNFRSF17 Protein, Fc Tag, Avi Tag (Avitag™), ACROBiosystems, Cat.No.BC7-H82F0)
PE 标记的链霉亲和素（PE-SA，Biolegend, Cat.No.405204)
检测流程：
1. 构建 anti-BCMA CAR 慢病毒载体，转染患者自体 T 淋巴细胞，转染 3 天后收集细胞，并用含 2% BSA 的 PBS 缓冲液洗两次；
2. 进行细胞计数，取 1*106 个转染后的 T 细胞加入每个离心管中；
3. 向每个加入细胞的离心管中加入 50ul 生物素标记的 BCMA 蛋白（ACROBiosystems, Cat.No.BC7-H82F0），4℃ 孵育 30 分钟，生物素标记的 BCMA 蛋白终浓度为 8ug/ml；
4. 30 min 后，离心后弃去上清，用含 2% BSA 的 PBS 缓冲液清洗细胞两次；
5. 每管加入 50ul PE 标记的链霉亲和素（Biolegend, Cat.No.405204)，4℃ 孵育 30 分钟， PE 标记的链霉亲和素的稀释比例为 1:50；
6. 30 min 后，离心并弃去上清，用含 2% BSA 的 PBS 缓冲液清洗细胞两次；
7. 每管加入 400ul PBS 中重悬细胞，用 BD FACSCalibur 流式细胞分析仪进行检测分析。
检测结果：
结果显示 1 号患者 anti-BCMA-CAR T 细胞阳性率在 52.72%，2 号患者 anti-BCMA-CAR T 细胞阳性率在 73.49%.
案例二：anti-CD19 CAR 表达阳性率检测
检测数据由 ACRO 应用开发团队自主研发提供！非常感谢！
检测方法：流式细胞术
检测仪器：NovoCyteTM Flow Cytometer, ACEA Biosciences
样本信息：R1013-C6 细胞 (过表达 Anti-CD19[FMC63] scFv & RFP tag 的 293F 细胞)
主要试剂：
生物素标记的 CD19 蛋白 (Biotinylated Human CD19, Fc Tag , ultra sensitivity (primary amine labeling), ACROBiosystems, Cat.No.CD9-H8259)
FITC 标记的链霉亲和素（FITC-SA，Biolegend, Cat.No.405201)
检测流程：
1. 用含 10% FBS 的 DMEM 培养基培养 R1013-C6 细胞，37℃，5% CO2 培养箱中；
2. 收集细胞，并用含 2% BSA 的 PBS 缓冲液清洗细胞 1 次；
3. 计数细胞，取 2*105 个 R1013-C6 细胞加入每个离心管中；
4. 每管加入 100ul 生物素标记的 CD19 蛋白（ACROBiosystems, Cat.No.CD9-H8259），混匀后在 4℃ 孵育 1 小时，生物素标记的 CD19 蛋白终浓度为 10ug/ml；
5. 离心并弃去上清，用含 2% BSA 的 PBS 缓冲液清洗细胞 1 次；
6. 每管加入 100ul 稀释的 FITC 标记的链霉亲和素（Biolegend, Cat.No.405201)，混匀后 4℃ 孵育 1 小时， FITC 标记的链霉亲和素的稀释比例为 1:500；
7. 离心后弃去上清，用含 2% BSA 的 PBS 缓冲液清洗细胞三次；
8. 每管加入 100ul PBS 重悬细胞，使用 NovoCyteTM Flow Cytometer 流式细胞分析仪进行检测分析。
检测结果：
结果显示生物素标记的 CD19 蛋白能够与 R1013-C6 细胞膜表面的 anti-CD19 CAR 特异性结合，这种结合能够被游离的抗 CD19 的抗体 FMC63 拮抗。
产品发布：
如果您对产品感兴趣或者想交流更细节的实验方案，可以通过下方联系方式和我们进行联系。
电话：400-682-2521
邮箱：（产品订购）order.cn@acrobiosystems.com
邮箱：（技术支持）techsupport@acrobiosystems.com
官网：http://www.acrobiosystems.cn/
CAR-T 细胞作为一种「活的药物」，其制备流程复杂，质控环节众多。CAR-T 表达阳性率的检测作为 CAR-T 疗法质量控制的重要一环，目前尚无标准的检测方案。据了解，企业内部常用的检测方案有利用 Protein L、Anti-Fab 抗体或靶点蛋白结合流式细胞术进行检测，其中靶点蛋白结合流式细胞术的检测方案因其特异性强的优势而备受业界人士的青睐。在法规尚不完全明朗的今天，很多业内人士预期靶点特异性的检测将会被 CFDA 纳入 CAR-T 质量控制监管考量的范畴。今天小编为大家带来的正是利用靶点蛋白结合流式细胞技术检测 CAR-T 表达阳性率的真实案例解析，以供大家参考。
案例一：anti-BCMA CAR 表达阳性率检测
检测数据由深圳普瑞金生物药业公司友情提供！非常感谢！
检测方法：流式细胞术
检测仪器：BD FACSCalibur 流式细胞分析仪
样本信息：转染 anti-BCMA CAR 的人原代 T 淋巴细胞
主要试剂：
生物素标记的 BCMA 蛋白 (Biotinylated Human BCMA / TNFRSF17 Protein, Fc Tag, Avi Tag (Avitag™), ACROBiosystems, Cat.No.BC7-H82F0)
PE 标记的链霉亲和素（PE-SA，Biolegend, Cat.No.405204)
检测流程：
1. 构建 anti-BCMA CAR 慢病毒载体，转染患者自体 T 淋巴细胞，转染 3 天后收集细胞，并用含 2% BSA 的 PBS 缓冲液洗两次；
2. 进行细胞计数，取 1*106 个转染后的 T 细胞加入每个离心管中；
3. 向每个加入细胞的离心管中加入 50ul 生物素标记的 BCMA 蛋白（ACROBiosystems, Cat.No.BC7-H82F0），4℃ 孵育 30 分钟，生物素标记的 BCMA 蛋白终浓度为 8ug/ml；
4. 30 min 后，离心后弃去上清，用含 2% BSA 的 PBS 缓冲液清洗细胞两次；
5. 每管加入 50ul PE 标记的链霉亲和素（Biolegend, Cat.No.405204)，4℃ 孵育 30 分钟， PE 标记的链霉亲和素的稀释比例为 1:50；
6. 30 min 后，离心并弃去上清，用含 2% BSA 的 PBS 缓冲液清洗细胞两次；
7. 每管加入 400ul PBS 中重悬细胞，用 BD FACSCalibur 流式细胞分析仪进行检测分析。
检测结果：
结果显示 1 号患者 anti-BCMA-CAR T 细胞阳性率在 52.72%，2 号患者 anti-BCMA-CAR T 细胞阳性率在 73.49%.
案例二：anti-CD19 CAR 表达阳性率检测
检测数据由 ACRO 应用开发团队自主研发提供！非常感谢！
检测方法：流式细胞术
检测仪器：NovoCyteTM Flow Cytometer, ACEA Biosciences
样本信息：R1013-C6 细胞 (过表达 Anti-CD19[FMC63] scFv & RFP tag 的 293F 细胞)
主要试剂：
生物素标记的 CD19 蛋白 (Biotinylated Human CD19, Fc Tag , ultra sensitivity (primary amine labeling), ACROBiosystems, Cat.No.CD9-H8259)
FITC 标记的链霉亲和素（FITC-SA，Biolegend, Cat.No.405201)
检测流程：
1. 用含 10% FBS 的 DMEM 培养基培养 R1013-C6 细胞，37℃，5% CO2 培养箱中；
2. 收集细胞，并用含 2% BSA 的 PBS 缓冲液清洗细胞 1 次；
3. 计数细胞，取 2*105 个 R1013-C6 细胞加入每个离心管中；
4. 每管加入 100ul 生物素标记的 CD19 蛋白（ACROBiosystems, Cat.No.CD9-H8259），混匀后在 4℃ 孵育 1 小时，生物素标记的 CD19 蛋白终浓度为 10ug/ml；
5. 离心并弃去上清，用含 2% BSA 的 PBS 缓冲液清洗细胞 1 次；
6. 每管加入 100ul 稀释的 FITC 标记的链霉亲和素（Biolegend, Cat.No.405201)，混匀后 4℃ 孵育 1 小时， FITC 标记的链霉亲和素的稀释比例为 1:500；
7. 离心后弃去上清，用含 2% BSA 的 PBS 缓冲液清洗细胞三次；
8. 每管加入 100ul PBS 重悬细胞，使用 NovoCyteTM Flow Cytometer 流式细胞分析仪进行检测分析。
检测结果：
结果显示生物素标记的 CD19 蛋白能够与 R1013-C6 细胞膜表面的 anti-CD19 CAR 特异性结合，这种结合能够被游离的抗 CD19 的抗体 FMC63 拮抗。
产品发布：
如果您对产品感兴趣或者想交流更细节的实验方案，可以通过下方联系方式和我们进行联系。
电话：400-682-2521
邮箱：（产品订购）order.cn@acrobiosystems.com
邮箱：（技术支持）techsupport@acrobiosystems.com
官网：http://www.acrobiosystems.cn/