经MALS验证的TNF超家族三聚体高活性蛋白，你值得拥有

1975年Carswell等人在卡介苗测试的小鼠血清中首次发现一种能使多种肿瘤发生出血性坏死的物质，并将其命名为肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor, TNF）。目前发现的TNF超家族蛋白（TNFSF）已经超过20种，主要由免疫细胞表达，包括TNF、41BBL、CD27L、RANKL、OX40L、APRIL等，生物学功能涉及免疫调节、组织形成、凋亡、炎症、感染性休克和自身免疫等，与癌症、心血管、自身免疫和代谢紊乱、多发性硬化、系统性红斑狼疮等众多疾病密切相关。

图1：TNF超家族蛋白配体及受体

随着研究的不断深入，TNF超家族蛋白（TNFSF）通路正在日益成为国内外药企竞相追逐的开发热点领域。2017-2019年，信达生物申请多个OX40抗体专利，其中四价OX40抗体显示比二价抗体有更好的激动剂活性。2020年伊始，复宏汉霖宣布公司自主研制针对RANKL的Denosumab（anti-RANKL）生物类似药HLX14获国家药品监督管理局临床试验注册审评受理，临床试验适应症为高危骨折风险的女性绝经后骨质疏松症。2020年3月7日，Viela Bio第二款靶向CD40的药物VIB4920的临床申请获得NMPA受理，VIB4920是一款靶向CD40的类抗体药物，由特异性结合CD40的Tn3 scaffold融合白蛋白而成，用于自身免疫疾病的治疗。

肿瘤坏死因子超家族蛋白（TNFSF）是一系列多功能促炎细胞因子，具有重要的生理和病理作用，可激活与细胞存活、凋亡、炎症反应和细胞分化相关的信号通路，与肿瘤发生、发展、浸润和转移等密切相关。TNF超家族蛋白在天然状态下常以膜锚定或可溶的三聚体形式存在，独特的三聚体结构有效促进和对应的TNF受体超家族蛋白（TNFRSF）的结合和三聚化，进而有效的激发下游通路（图2），引起包括细胞生长、细胞凋亡、炎症激活等生理功能。

图2. TNF-α与TNFR1的胞外区结合引起细胞凋亡的机制

可见，肿瘤坏死因子超家族蛋白（TNFSF）的天然聚集状态是决定其生物活性和生理功能的重要性质之一，也是抗体药物成功快速开发的先决条件。使用具有天然三聚体结构的蛋白免疫得到的抗体，在体内将能更好的识别天然抗原表位，有效的阻断受体和配体的结合，达到预期的治疗效果。只有正确折叠和构象的重组靶点蛋白才能有效保证抗体药物研发过程的顺利进行。因此，抗体药物的开发用重组靶点蛋白必须具有正确的聚集状态和结构，保证靶点蛋白正确的生物活性和功能。这就要求重组蛋白生产商建立准确可靠的分子量测定方法，在生产过程中严格控制蛋白聚集状态，同时严格验证蛋白的细胞功能或生物学活性。

为满足药物开发对于高质量重组靶点蛋白的需求，ACROBiosystems目前推出由HEK293表达的经过MALS验证的TNF超家族三聚体蛋白产品，准确表征其天然聚集状态，具有更好的产品均一性，同时产品经过多种活性功能测试，可以直接用于药物开发的各种应用场景，成功用于大分子抗体药物的免疫、SPR、细胞功能筛选等应用，更有Avitag^TM生物素标记的蛋白助力于您的药物开发。

Fig.1 The purity of Human OX40 Ligand, His Tag, active trimer (Cat. No. OXL-H52Q8) was more than 95% and around 60-80 kDa verified by SEC-MALS.

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蛋白的生物活性由FACS、细胞功能实验、SPR、BLI、ELISA多种技术的验证

Fig.2 FACS analysis shows that Human CD40 Ligand, Fc Tag (active trimer) (MALS verified) (Cat. No.CDL-H5269) can bind to 293T-CD40 cells surface CD40. The concentration of Human CD40 Ligand is 0.3 μg/mL (Routinely tested).

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Fig.3 Human 4-1BB Ligand (71-254), His,Flag Tag (active trimer) (MALS verified) (Cat. No. 41L-H52D4) induce IL-8 secretion in HT1080 human CD137 cell line. The EC50 for this effect is 0.20-0.44 μg/mL (Routinely tested).

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Fig.4 Human LIGHT, His Tag, active trimer (MALS verified) (Cat. No. LIT-H5242) induced cytotoxicity in HT-29 cells. The ED50 for this effect is 1.11-3.87 ng/mL.

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Fig5. Anti-TNFSF11 (human IgG1) captured on CM5 chip via Anti-human IgG Fc antibodies surface can bind Human TNFSF11, His Tag (active trimer) (MALS verified) (Cat. No. RAL-H5240) with an affinity constant of 0.274 nM as determined in a SPR assay (Biacore T200) (Routinely tested).

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Fig.6 Loaded Human 4-1BB Ligand (71-254), Fc Tag (active trimer) (MALS verified) (Cat. No. 41L-H5265) on Protein A Biosensor, can bind Cynomolgus / Rhesus macaque 4-1BB, His Tag (Cat. No.41B-C52H4) with an affinity constant of 10.3 μM as determined in BLI assay (ForteBio Octet Red96e) (Routinely tested).

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参考资料：

1. Harper et al. Induction of TNF Receptor I-Mediated Apoptosis via Two Sequential Signaling Complexes. Cell. 2003.

2. Paula et al. A Review Size-Exclusion Chromatography for the Analysis of Protein Biotherapeutics and their Aggregates. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 2012.

3. Some et al. Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS). Journal of Visualized Experiments. 2019.