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CAR 表达检测指南：一文读懂 CAR 表达检测试剂怎么选
8855 人阅读发布时间：2021-08-02 10:43
对于 CAR-T 细胞来说，发挥肿瘤杀伤作用的有效成分是 CAR 阳性的 T 细胞，CAR-T 细胞产品的包装规格及临床使用剂量是以 CAR-T 阳性细胞数表示的，因此，CAR 转染阳性率是 CAR-T 细胞产品质量控制的必检项，监管部门建议应采用流式细胞法（FACS）检测 CAR 转染阳性率。目前，针对 CAR 不同结构区域的检测方法，包括针对 CAR 抗原结合位点的，比如 CD19 抗原和抗独特型抗体，或针对轻链或铰链区的抗 Fab 抗体、Protein L 蛋白。➞文末可下载细胞治疗质量控制相关指导原则和政策解读相关文件哦～
那么，如何选择合适的 CAR 表达检测试剂呢？接下来，小编结合各种检测试剂的检测原理和优缺点，帮您选择出最合适的 CAR 表达检测试剂～
通用型 CAR 检测试剂
>> 抗 Fab 抗体
抗 Fab 抗体可识别抗体 Fab 段，可与含有 Fab 段可变区的 scFv 结合而达到检测 CAR 表达的目的（图 1），具有一定的通用性，可检测不同靶点的 CAR。商品化的抗 Fab 抗体产品质量参差不齐且多数为多抗，批间一致性较差。来自 Jackson ImmunoResearch Laboratories 的多克隆山羊抗小鼠 F (ab) 2 抗体是目前使用最广泛的抗 Fab 抗体，曾用于上市药物 Yescarta 的抗 CD19 CAR 表达检测 [1]。
是一种消化链球菌的表面蛋白，Protein L 可识别抗体的 Kappa 轻链，可与含有 Kappa 可变区的 scFv 结合而达到检测 CAR 表达的目的（图 1），可用于检测人 VKI、VKIII、VKIV 亚型和鼠 VKI 亚型的 CAR，但不能检测人 VκII 亚型和鼠 Ig 的其他亚型的轻链。Protein L 也具有一定的通用性，可检测不同靶点的 CAR。需要注意的是，在 Protein L 染色之前需要对细胞进行多次洗涤，严格去除血清或培养基中的残留免疫球蛋白，否则会出现严重的非特异背景。
图 1 抗 Fab 抗体和 protein L 的 CAR 检测结合位点
要点：
- 染色前后需要严格洗涤，否则会与非 CAR 的 IgG 样蛋白交叉反应而出现严重非特异；
- 做多色染色时，与其他抗体或 FcX 封闭试剂不兼容；
- 不能对双靶点 CAR 细胞上的单独 CAR 分别染色；
- 不能对合成的 CAR 进行检测。
靶抗原蛋白
- 可与 CAR 特异性结合，具有 CAR 功能性验证作用；
- 可检测双靶点 CAR-T 细胞中单 CAR 的表达；
- 荧光标记的靶抗原蛋白，可一步染色完成检测 CAR 表达，减少非特异背景并节约时间；
- 还可用于激活 CAR-T 细胞；
- 价格相对 Protein L 等通用型检测试剂较贵。
抗独特型抗体
另外，抗独特型抗体分具有中和活性和无中和活性的抗独特性抗体，在进行临床 PK 研究时，使用具有中和活性的抗独特性抗体，可以检测到游离的 CAR 阳性 T 细胞（指没有跟体内抗原结合的 CAR-T 细胞），而使用没有中和活性的抗独特性抗体，检测的是总的 CAR 阳性 T 细胞量（包括跟体内肿瘤抗原结合和没有结合的 CAR-T 细胞）。
- 特异性结合 CAR 的 scFv；
- 高特异性和高灵敏度，且非特异背景低，适用于检测临床样本；
- 具有中和活性的抗独特型抗体，可检测到游离的 CAR 阳性 T 细胞；
- 具有靶点专属性，开发周期长；
图 2 靶点蛋白和抗独特型抗体分别检测 CAR 阳性率的原理
总结
总体来看，Protein L、抗 Fab 抗体、靶抗原蛋白以及抗独特型抗体作为 CAR 表达检测试剂均有各自的优缺点，结合实际的应用情况，有以下几点建议供参考：
-
尽量不使用 Protein L 或抗 Fab 抗体，避免高非特异，导致实验结果不易分析；
-
抗体筛选、方法开发、质控等阶段建议选用抗原蛋白，保证筛选到的 scFv 具有功能性作用和质控方法的稳定性；
-
对于后期临床阶段来说，抗原蛋白为第一选择，来确保临床 PK 等药效学研究结果的可靠性，但对于临床样本，存在细胞组分比较复杂、CAR-T 细胞含量较低等问题，导致 CAR 检测难度加大，因此，可选择灵敏度较高的抗独特型抗体检测临床样本。
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参考文献：
[1] Kochenderfer JN, Feldman SA, Zhao Y, Xu H, Black MA, Morgan RA, et al. Construction and preclinical evaluation of an anti-CD19 chimeric antigen receptor. J Immunother. (2009) 32:689–702.
[2] Jena B, Maiti S, Huls H, Singh H, Lee DA, Champlin RE, et al. Chimeric antigen receptor (CAR)-specific monoclonal antibody to detect CD19-specific T cells in clinical trials. PLoS ONE. (2013) 8:e57838.
[3] Gomes-Silva D, Mukherjee M, Srinivasan M, Krenciute G, Dakhova O, Zheng Y, et al. Tonic 4-1BB costimulation in chimeric antigen receptors impedes T cell survival and is vector-dependent. Cell Rep. (2017) 21:17–26.
[4] Hu Y, Huang J. The Chimeric Antigen Receptor Detection Toolkit. Front Immunol. 2020;11:1770. Published 2020 Aug 11.
[5] https://ishare.ifeng.com/c/s/7xXSe4KmgTS
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