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为什么我们需要全长 CD20,看 Genentech 对 CD20 的结构解析

发布时间:2020-03-02 10:32 |  点击次数:

2020 年 2 月 20 日,Science 在线发表了 Genentech CD20-利妥昔单抗复合物冷冻电镜结构的文章:「Structure of CD20 in complex with the therapeutic monoclonal antibody rituximab」<文尾可下载文献全文>.

 

文章突破性的解析了全长 CD20 以及 CD20 与 RTX Fabs 复合物的三维结构,同时首次揭示了 RTX 对 CD20 的识别表位以及全长 CD20 在相关研究中的重要意义。此前认为 RTX 对 CD20 的识别表位位于 ECL2,该研究发现 RTX 对 CD20 的识别不止有一级表位 ECL2(170ANPSE174),还包括二级表位 ECL1-ECL2。通过 SPR 实验比较 RTX 与全长 CD20 以及与 CD20 ECL2 多肽表位的亲和力差别,进一步揭示了 ECL1-ECL2 二级表位对 RTX 与全长 CD20 达到 nM 级亲和力所起到的关键性作用。
 


Fig. 3. Key molecular interactions between CD20 and RTX. Ribbon diagrams of the CD20:RTX Fab structure, with key amino acid side chains involved in CD20:RTX or RTX:RTX shown in stick representation. (A) Top view of the center of the complex, where HC.Tyr97 mediates Fab:Fab and Fab:CD20′ contacts. (B) The canonical RTX epitope 170ANPSE174, in addition to being recognized by RTX’s heavy chain (left, purple), is also involved in a hydrogen bond network with Tyr97′ from the distal RTX Fab (right, grey). (C) Additional Fab:Fab contacts between heavy chain (HC) loops H3 and H1 and light chain (LC) loop L2. (D) A secondary epitope consisting of ECL1 and ECL2 is contacted by RTX’s LC loop 

<图片来自文献,文尾可下载>

 

更重要的是,该研究发现将 RTX 中识别 ECL1-ECL2 二级表位的关键位点(LC.Ser28)突变后,不同程度的减弱了 RTX-CD20 affinity(~20 倍)、RTX-cell binding(~25%)和 RTX 的 CDC activity(IC50 > 10x higher), 而将 RTX 中识别 ECL1-ECL2 二级表位的另一关键位点(LC.Ser31)进行突变,则更大程度的减弱了 RTX-CD20 affinity(~100 倍)、RTX-cell binding(~50%),且导致 RTX 的 CDC activity 几乎完全淬灭。可以说,无论是 RTX 对 CD20 独特的 binding 模式,还是 RTX 的高 CDC activity,均离不开 ECL1-ECL2 二级表位,也表明了相比于 ECL2,全长 DC20 在相关研究中的重要意义。
 


Fig. 4. Multiple CD20:RTX and RTX:RTX interactions enable cell binding and CDC. (A) Surface representation of the CD20:RTX Fab complex. The surfaces buried by complex formation are colored in yellow (CD20:RTX), orange (CD20′:RTX′), or red (RTX:RTX′). (B) Open-book representation of the same surfaces, with surface area measurements for each buried surface indicated. Residues mutated as part of this study are labeled in the top left panel and are not involved in the primary paratope. The primary epitope (dashed line) only accounts for less than half (440 Å2 out of 1,015 Å2) of the total Fab binding area. (C) Surface representation of the CDR face of RTX Fab, with the ECL2 turret epitope shown (green), as well as the positions of the point mutations under study. (D and E) Complement-dependent cytotoxicity (D) and cell binding (E) of RTX mutants are plotted as a function of antibody concentration, and compared to wild-type RTX and OBZ.

<图片来自文献,文尾可下载>

 

为了解决这些问题,ACROBiosystems 采用独特的设计开发了全球独有的由 HEK293 表达的多次跨膜全长 CD20 蛋白,包括未进行标记的和生物素标记的 Nanodisc 或 DDM 不同版本产品。全长 CD20 蛋白同时有 small loop 和 big loop,具有完整的天然正确构象,可用于免疫 / ELISA / SPR / BLI / FACS。我们验证了 Rituximab、Ofatumumab 与全长 CD20 蛋白的结合活性,全长 CD20 蛋白展现出纳摩尔级别的高亲和力,可免费提供 Protocol。

 

不同类型的全长 CD20 蛋白


>>>>DDM 版本

DDM 是一种非离子型去垢剂,能够使脂膜解体释放膜蛋白,并在溶液中为去膜状态下的膜蛋白提供疏水环境,维持和保护膜蛋白的疏水跨膜结构。但 DDM 的存在会破坏细胞膜的结构,一般不用推荐于细胞实验。

>>>>Nanodisc 版本(不含去垢剂)

Nanodisc(纳米磷脂盘)是由膜支架蛋白(membrane scaffold proteins, MSPs)和磷脂分子构成的磷脂双分子层类膜结构,膜蛋白可以整合到 Nanodisc 的特殊结构中,保持其生物学活性并有很好的水溶性,应用更广泛。ACROBiosystems 使用的 Nanodisc 技术已经获得专利持有方的授权,生物药研发企业在研发过程中可放心使用。


Ilia G. Denisov, et al., Nanodisc in membrane biochemistry and biophysics. Chem Rev. 2017


 

全长 CD20 蛋白能提供更好的活性


 

ACRO 提供的全长 CD20 蛋白活性经 ELISA / SPR / BLI 验证,可免费提供相应的 Protocol



Loaded MabThera® (Rituximab) on ProteinA Biosensor, can bind Human CD20 Full Length, His Tag, HEK293 (SPR verified) (Cat. No. CD0-H52H3) with an affinity constant of 8.1 nM as determined in BLI assay (ForteBio Octet Red96e).  

 

产品列表


ACRO 开发的生物素标记的全长 CD20 蛋白(DDM 和 Nanodisc)经 FACS 验证具有高生物活性。
 

Cat. No. Type Product Description
CD0-H52H3    Unconjugated Human Full Length CD20 Protein, His Tag (DDM) 
CD0-H82E5 Biotinylated

Biotinylated Human Full Length CD20 Protein, His,Avitag™ (DDM)

CD0-H82E3 

Biotinylated Biotinylated Biotinylated Human Full Length CD20 Protein, His,Avitag™ (Nanodisc)

 

来看下用过我们 CD20 全长蛋白的他们都说了什么~


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>点击下载《Structure of CD20 in complex with the therapeutic monoclonal antibody rituximab》文献全文