mRNA质量守门人：DNase与RNase防控

随着mRNA药物从预防性疫苗加速拓展至个性化肿瘤疫苗、In Vivo CAR等体内治疗领域，生产工艺中的杂质控制日益成为CMC开发的核心议题。本文从mRNA生产工艺角度，系统梳理生产工艺过程中DNase/RNase的控制要点，介绍基于FRET荧光探针法的高灵敏度检测方案，以及ACROBiosystems百普赛斯覆盖mRNA工艺开发全流程的服务体系。

mRNA的典型生产工艺包括：质粒DNA模板制备与线性化、IVT体外转录、DNase I消化去除DNA模板、mRNA纯化（层析/过滤）、5'端加帽与3'端Poly(A)加尾修饰、以及最终的QC放行检测。

图1 mRNA生产工艺流程

这一生产体系涉及模板DNA、T7 RNA聚合酶、NTP底物、加帽酶、DNase I等多种原料，反应体系复杂。与传统生物制品不同，mRNA药物在体内直接表达目标蛋白，任何微量工艺杂质都可能被放大为体内安全性风险或影响产品效价。在众多工艺相关杂质中，核酸酶的控制贯穿从上游原料入库到下游成品放行的全过程，是决定mRNA产品质量与一致性的关键环节。

DNase I在mRNA工艺中的唯-一应用场景，是IVT反应结束后对线性化DNA模板进行酶切消化。该过程是为了避免残留的 DNA模板引发机体炎症反应，并带来外源基因整合的潜在风险。其控制要点包括两个方面：

一是残留清除。DNase I本身作为蛋白类工艺杂质，在完成模板消化后须经下游纯化步骤去除至安全限以下，并建立相应的残留检测方法。

二是试剂质量。部分DNase I制剂可能存在RNase污染，在消化DNA的同时降解目标mRNA。建议选用经确认无RNase污染的DNase I原料，降低“边除DNA边毁RNA”的风险。

RNase在自然环境中几乎无处不在——操作人员的皮肤、移液器、离心管、缓冲液，甚至其他原料酶（如T7 RNA聚合酶、逆转录酶）中都可能存在。对于mRNA这种极其脆弱的单链分子而言，皮克级的RNase残留就足以导致产品降解、完整性受损、效价下降。因此在IVT反应及后续处理的各个环节，都需要进行严格的RNase控制，主要包括：

生产环境的表面、空气和操作人员均是潜在的RNase污染来源。mRNA生产应在受控洁净区内进行，对操作台面、生物安全柜、传递窗、移液器外壁及人员手套等关键点位定期擦拭取样，并使用核酸酶清除剂对环境表面进行去RNase处理；监测结果应纳入生产质量管理体系，发现异常时及时溯源并采取纠正措施。

mRNA生产涉及多种关键原料酶，每一种都可能成为RNase污染的来源，建议在原料酶生产商评估产品出厂时RNase残留情况，企业入厂质控时进行RNase活性测定。重点监测对象包括：T7 RNA聚合酶、RNase抑制剂、加帽酶及甲基转移酶、Poly(A)聚合酶、无机焦磷酸酶、DNase I等。其中DNase I制剂的RNase污染尤其需要关注——其在消化DNA模板的同时可能降解目标mRNA；建议优先选择RNase-free认证、批次间活性稳定的原料酶，并留存每批原料的RNase活性检测报告。

在IVT反应体系中加入适量RNase抑制剂（如鼠源RNase Inhibitor），可在转录过程中保护新生mRNA免受RNase降解。同时应合理控制反应时间与温度，减少mRNA在反应液中的暴露时长；反应结束后应及时转入纯化步骤，避免mRNA长时间停留于开放环境。

除原料酶外，生产纯化过程中使用的水、转录缓冲液、洗脱缓冲液、mRNA储存缓冲液等液体试剂，移液器吸头、离心管、层析介质、过滤系统、一次性储液袋等耗材，都可能携带RNase污染。因此建议定期对生产用水进行检测评估，缓冲液采用无RNase水配制，并明确配制后的使用期限；耗材选用经RNase-free级别认证的产品；对开瓶试剂及重复使用的设备、管路建立清洁与去RNase维护程序。关键缓冲液和耗材应定期抽检，并对生产过程中的中间品进行RNase酶活监测。

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传统的检测方法对于低浓度核酸酶的检测均存在明显局限：凝胶电泳法耗时长、只能半定量且灵敏度较低；紫外分光光度法特异性差、易受干扰；HPLC等方法则受限于仪器配置，不适合高通量筛查。

针对mRNA生产过程中对核酸酶质控要求以及传统检测方法的检测局限性，ACROBiosystems百普赛斯基于FRET荧光探针原理，自主研发了resDetect™ DNase及RNase荧光酶活检测试剂盒。两款试剂盒均经过严格的方法学验证，可实现对环境、耗材、原料及生物制品中痕量核酸酶残留的快速、准确定量，协助用户快速识别生产过程核酸酶残留的风险，提供mRNA产品生产工艺全流程保障。

图2 FRET荧光探针检测原理图

表1 resDetect™ DNase/RNase荧光酶活检测试剂盒核心参数

灵敏度高

从30min的检测信号分析，DNase检测灵敏度可达到3.90625*10^-5U

稳定性好

探针反复冻融3次，测试性能仍符合要求，灵敏度无降低，CV<10%

高效的同孔检测DNase和RNase

在qPCR（左图）和酶标仪上（右图）均可同时检测含有DNase和RNase的样本，DNase和RNase检测结果无交叉干扰

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