MHC-多肽复合物四聚体——深挖HPLC纯度控制要点_公司新闻

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MHC-多肽复合物四聚体——深挖HPLC纯度控制要点

人阅读发布时间：2023-10-19 14:24

MHC-多肽复合物四聚体（MHC-Peptide Complex Tetramer）常用于TCR-T疗法、TCR蛋白药、类TCR抗体等药物的开发过程中，值得关注的是四聚体纯度如果控制不好，会直接影响免疫效果、TCR检测结果等，保证MHC-多肽复合物四聚体的高纯度是药物开发成功的关键！为了弄清楚MHC-多肽复合物四聚体纯度控制的问题，小白同学来到ACROBiosystems百普赛斯实验室向团子博士虚心请教~

Q：小白同学：团子博士，MHC-多肽复合物四聚体纯度如此重要，通常是如何检测控制纯度呢？

A:团子博士：

通常会使用高效液相色谱HPLC-SEC，该方法已在重组蛋白的纯度检验、生物药的多聚体（二聚体、三聚体、四聚体等）分析中广泛应用，这是一种根据试样分子大小尺寸进行分离的色谱技术，其原理主要是：大分子无法进入填料颗粒内部从而被迅速洗脱，较小分子可以进入填料颗粒中，也可以从颗粒间流过，但是分子量越小，在颗粒内部流动的路径越多，在颗粒孔内扩散的时间就越长，洗脱的时间也更长；反之，分子量越大，洗脱时间越短；最小的分子会进入颗粒内部所有孔隙并最后洗脱，从而对所分析的生物聚合物进行分离。

HPLC-SEC的分离原理

Q：小白同学：这确实是一个非常不错的检测手段，那使用HPLC-SEC检测MHC聚集体纯度时，有什么需要注意的吗？

A:团子博士：

不同孔径的HPLC柱子具有不同的分离分级范围，这会直接影响分析得到的HPLC谱图，需要根据待测蛋白的分子量选择正确的柱子型号。如从某HPLC厂家资料来看，G2000柱分级范围5-150kDa，那么，理论上150kDa以上的蛋白会在外水出峰，无法分辨150kD以上的蛋白。从下面的样品分离图谱可以看出，使用G2000柱子，160kD的IgG和660kDa的甲状球蛋白（某检测样本）分离度非常小（黄色区域），而MHC四聚体分子量258kDa左右，如果2个或更多四聚体进一步产生八聚或高聚，分子量会是516kDa或更高MHC四聚体，基于此可以预见，如果两个峰之间（黄色区域）再插入258kD和516kD的两个峰，将无法有效分离开，MHC四聚体和高聚体会合并为一个峰在外水被洗脱出来，导致MHC四聚体纯度分析结果虚高，因此选择合适的HPLC柱子进行MHC四聚体分析，对于分析结果非常关键!

色谱柱：TSKgel SWXL 系列，7.8mm ID x 30cm;

溶剂：0.05mol/L 磷酸盐缓冲液（pH 7）+ 0.3mol/L NaCl;

流速：1mL/min;

柱温：25℃;

检测：UV@220nm样本：1.甲状球蛋白（thyroglobulin, 660kDa）2. IgG（160kDa） 3.牛血清白蛋白（BSA, 67kDa） 4.核糖核酸酶 A（ribonuclease A, 13kDa） 5. VB12 （1.3kDa）

Q：小白同学：竟然有这么大的影响！那您在选择合适的HPLC柱子方面有什么建议吗？如果有案例分享就更好了！

A: 团子博士：

当然可以，以HLA-A2/NY-ESO-1 Tetramer为例，其理论分子量为258KDa，参考厂家不同HPLC柱子的分级范围，G2000柱分级范围5-150kDa，G3000柱子分级范围是10-500kDa，将HLA-A2/NY-ESO-1 Tetramer（Company K）分别使用G2000柱和G3000柱进行验证分析，结果发现两种柱子下的测试结果有非常明显的差异！

▶使用G3000SWXL柱子时的HLA-A2/NY-ESO-1 Tetramer（Company K）聚集纯度检测结果

设备：安捷伦HPLC 1260 高效液相色谱仪,怀雅特MALS DAWN8；

色谱柱：G3000SWXL，7.8mm ID x 30cm；

溶剂： 0.2M Na2HPO4,1%IPA,pH7.0；

流速： 0.5 mL/min；

柱温： 25℃；

检测： UV@280nm；

样品： Human HLA-A*02:01&B2M&NY-ESO-1 (SLLMWITQC) Tetramer Protein (Company K）

▶使用G2000SWXL柱子时的HLA-A2/NY-ESO-1 Tetramer（Company K）聚集纯度检测结果

设备：安捷伦HPLC 1260 高效液相色谱仪,怀雅特MALS DAWN8；

色谱柱：G2000SWXL，7.8mm ID x 30cm；

溶剂： 0.2M Na2HPO4,1%IPA,pH7.0；

流速： 0.5 mL/min；

柱温： 25℃；

检测： UV@280nm；

样品： Human HLA-A*02:01&B2M&NY-ESO-1 (SLLMWITQC) Tetramer Protein (Company K）

根据结果，可看出，使用孔径较小的G2000SWXL，无法区分MHC四聚体和更高的聚集体，会导致分子量150k以上的所有组分合并成一个外水峰，掩盖四聚体的真实聚集状态，造成纯度检测结果虚高；而G3000柱子分级范围是10-500kDa，这样我们刚才说的160kD的IgG和660kDa的甲状球蛋白两个峰之间有了较大的余地，可以较好的区分MHC四聚体和高聚体（258kD和516kD等）。因此，这很好的验证了并非所有HPLC柱子都能体现其真实的MHC四聚体的纯度， 应选择型号为G3000的HPLC硅胶柱进行MHC四聚体的纯度分析，避免使用小孔径的G2000柱带来的纯度虚高的假象，干扰蛋白的性能评价和选择，对药物开发的结果造成无法预估的损失。