致敬百年荧光：读懂TR-FRET，从分子间的能量转移走向生物药研发

今天（8月26日）是 James Franck 诞辰 144 周年。这个名字对很多人来说或许陌生，但他 1922 年与 Cario 合作完成的一项实验——用 253.6 nm 波长仅激发汞原子，却意外观测到原子的 535 nm 荧光——第一次让人类亲眼"看见"了分子间的能量转移。这项实验被公认为共振能量转移研究的起点。

此后百年，从 Jean Perrin 到 Theodor Förster，从 FRET 到 TR-FRET，这条技术脉络一直延续到今天生物制药研发的实验室中。我们之所以在今天聊 TR-FRET，某种程度上，也是在致敬那束跨越了 104 年的荧光。

James Franck

德国实验物理学家，诺贝尔物理奖得主

在现代生物制药研发中，"如何把一个生物学事件转化成可靠、灵敏、可重复检测的信号"是药物发现和药效评价的核心问题之一。TR-FRET (Time-Resolved Fluorescence Resonance Energy Transfer，时间分辨荧光共振能量转移）正是在这一背景下逐渐发展起来的。它将两个经典概念结合在一起：

一、TR-FRET 从哪里来？先从 FRET 讲起

理解 TR-FRET，首先必须理解 FRET。

FRET 的理论基础来自德国物理化学家 Theodor Förster。1948 年，Förster 发表了关于分子间激发能量转移的经典理论工作，建立了后来被称为 Förster 共振能量转移的理论框架。该理论描述了一个荧光分子吸收能量后，如何通过非辐射方式将激发能量转移给距离足够近的另一个受体分子。

"The correct interpretation of an observation" —— Theodor Förster

在这个体系中，通常需要两个荧光基团：

• Donor，供体；

• Acceptor，受体。

当供体被激发以后，如果受体位于足够近的距离（<10 nm），就可以发生能量转移。FRET 最重要的特征是其对距离高度敏感。FRET 效率通常可以表示为：

由于存在六次方关系，这意味着供体和受体之间哪怕只有几个纳米的距离变化，也可能造成明显的 FRET 信号变化。因此，FRET 能够被用于研究：蛋白-蛋白相互作用、小分子药物筛选、酶反应、配体竞争等应用场景。

二、从 FRET 到 TR-FRET，关键的技术融合

TR-FRET 其实并不是突然"被发明"的，而是 FRET 理论、镧系元素时间分辨荧光以及均相生物分析技术逐步融合的结果。

仅仅是 FRET，还远远不够。在这个实验体系里不只有 Donor 和 Acceptor，还有样品。样品并不是一个纯净的光学体系，蛋白质、细胞裂解液、培养基以及化合物库中的某些小分子，都可能产生自发荧光。尤其在高通量筛选中，大量化合物本身具有颜色或荧光，会与检测信号发生重叠。因此，即使一个 FRET 反应本身具有很好的信号，检测器最终看到的仍然可能是：真实FRET信号 + 样品自发荧光 + 化合物荧光 + 光学散射 + 非特异性信号——这将会产生假阳性或假阴性。

在 FRET 的发展历程中引入了镧系元素，如 Europium (Eu³⁺) 和 Terbium (Tb³⁺)。镧系元素具有一些非常特殊的光物理性质，其荧光寿命可达到微秒甚至毫秒数量级，而普通荧光染料的荧光寿命通常非常短（纳秒数量级）。于是检测策略也发生了变化：

1. 用光脉冲激发供体；

2. 等待一小段时间；

3. 让短寿命的背景荧光快速衰减；

4. 再采集仍然存在的镧系元素相关荧光以及 FRET 信号。

这就是 Time-Resolved Fluorescence（TRF，时间分辨荧光）的技术原理。

TR-FRET 原理图

三、TR-FRET 普及：从实验室技术走向药物筛选平台

TR-FRET 真正大规模进入生物制药研发，并不是因为它在理论上漂亮，而是因为它恰好解决了高通量药物筛选时代的一系列现实问题。

随着组合化学、自动化液体处理、AI智药的发展，候选分子库规模不断扩大。检测体系需要实现：少步骤、低体积、易自动化、结果重复性高，兼容384/1536 微孔板。

TR-FRET 可以在均相体系中完成反应，不需要洗涤、分离或固相处理——这种 "Add-Mix-Read" 模式适配自动化高通量流程，成为药物筛选的有力工具。

另外，TR-FRET 技术一个独特的优势在于：利用 Donor 信号（620 nm）作为对照，对体系中共同的信号变化进行归一化，从而降低孔间/板间变异，提高结果的可信度。

TR-FRET 通常采用比值信号（665 nm / 620 nm）来减少孔间的"总信号量差异"：

假设两个孔实际产生的 FRET 程度完全一样，但 A 孔加了 100% 的试剂，B 孔因为移液误差只有 90%，又或者细胞数量、蛋白量等略有不同，那么 A、B 两孔的 Acceptor 绝对荧光强度就会不同。如果只看F_Acceptor，很容易把这种"量的差异"误认为是生物学效应。

例如：

虽然 B 孔整体信号低了 10%，但 ratio 仍然是 5000。所以 ratio 在一定程度上相当于对"总量"进行了归一化。

另外，采用信号比值还可以抵消很多系统误差，提高该检测体系的抗干扰能力，如加样体积差异、试剂浓度轻微变化、孔间液体体积差异、部分荧光淬灭或基质效应、蛋白或抗体浓度差异等。

四、不只筛选，TR-FRET 也可以用于定量检测

在生物分析领域，TR-FRET 还有另一条成熟的应用路径——定量检测。

这类检测的思路与前面的蛋白互作实验有所不同。以细胞因子检测为例，通常采用双抗体夹心的 TR-FRET 设计。一个抗体偶联供体荧光基团，另一个针对不同表位的抗体偶联受体荧光基团。当样品中存在目标细胞因子时，两个抗体同时结合目标蛋白，使已标记了 Donor 和 Acceptor 的抗体在空间上靠近，从而产生 FRET 信号。

因此，检测体系建立的是这样一个关系：

目标蛋白浓度 ↑ → 形成的结合复合物 ↑ → TR-FRET 信号 ↑

在此基础上，使用一系列已知浓度的标准品建立标准曲线，再将未知样品的检测信号代入曲线，就可以得到样品中目标蛋白的浓度。与传统需要洗涤、分离的免疫检测方式相比，抗体结合、FRET 信号形成和最终读取都可以在同一个反应体系中完成，尤其适合需要大量样本平行检测的场景。

五、利用 Toolbox 自己开发个性化 TR-FRET 体系

在实际的 Assay 开发阶段，很多研究人员觉得 TR-FRET 必须依赖一个已经开发完成的 Kit。但是其实 TR-FRET 是一种灵活的技术方法，其强大的模块化特性允许研究者像搭积木一样，自由组合标记与靶点。

以 PPI 为例，一个完整 TR-FRET 体系，可以拆成几个模块：Donor、Acceptor、Protein 1、Protein 2、Detection buffer。

其中 Protein 1 和 Protein 2 是目标研究物，而 Toolbox 则扮演"信号桥梁"的角色，提供标准的 Donor 和 Acceptor 组件，将生物学互作转化为 TR-FRET 信号。

Toolbox 并不是一个已经固定的 Assay，而是一套可以自由组合的"TR-FRET 乐高积木"。你的靶点是什么、样本是什么、带什么标签、有没有 Biotin 标记，决定了应该选择哪一块积木；最终通过不同组合的比较，找到最适合这个具体体系的 Toolbox Pair。学会使用 Toolbox 后，你不再受限于现有商业化检测试剂盒对你的限制：找不到自己想要的试剂盒？使用 Toolbox，自己动手试试看！

那么该怎么用呢？以 PPI 为例，我们建议的流程是：先建立蛋白结合体系，确认目标蛋白之间能够产生稳定的 TR-FRET 信号，再比较不同 Toolbox Pair，选择具有较好信噪比的组合，之后才进入实验等进一步开发。

第一步：试剂选择——先看自己的蛋白，再决定怎么"搭"

搭建一个 TR-FRET 体系，并不需要一开始就设计一套复杂的化学标记方案。最简单的判断方法，是先看 Protein 1 和 Protein 2 手里有什么"可利用的抓手"。

▾ Donor-Acceptor 配对方案参考图

根据蛋白的标签和标记情况，TR-FRET体系可以采用不同的构建方式。例如，可以利用蛋白的His、GST、Fc等标签，通过Anti-Tag实现间接连接；对于Biotin等修饰，则可以借助Streptavidin等亲和体系建立Donor或Acceptor连接。不同方案的核心都是一样的——将Donor和Acceptor分别连接到目标蛋白上，蛋白发生相互作用时两者靠近并产生TR-FRET信号。

第二步：结合方法验证——Donor 和 Acceptor 不是"随便选一对"，而是要通过实验找到最佳组合

同一组蛋白，往往可以搭出不止一种 TR-FRET 组合。以一个带 Biotin 的蛋白和一个带 His Tag 的蛋白为例，既可以让 Streptavidin-Eu 作为 Donor、Anti-His-FA 作为 Acceptor，也可以反过来使用 Anti-His-Eu 和 Streptavidin-FA。

两种设计在理论上都能产生 TR-FRET，但实际检测表现未必一样。

 例如：PD-1/Anti-PD-1Antibody互作实验TR-FRET体系搭建

▾体系搭建原理图

▾ PD-1/Anti-PD-1 Antibody 互作实验结果

结果表明，使用 Streptavidin Protein-Europium chelate (ACRO, Cat. No. FRT-TD09) 作为 Donor、Monoclonal Anti-Human IgG Antibody FA-Labeled (ACRO, Cat. No. FRT-TA02) 作为 Acceptor 的组合能产生最大的信号窗口（S/N）。数据同时显示，较低蛋白浓度可产生最大的信号窗口，而较高蛋白浓度有钩状效应，这解释了信号窗口下降的原因。

第三步：阳性对照验证——验证体系是否真正建立起来

设置阳性对照，确认已经搭建好的 TR-FRET 体系确实能够对预期的生物学事件产生响应；同时设置阴性对照以评估体系的背景水平。

如果阳性对照能够稳定建立 TR-FRET 信号，同时阴性对照保持较低的背景，就说明前面选择的试剂组合已经具备进一步开展实验的基础。如果是竞争性实验，还可以在这一基础上加入已知的竞争分子，确认随着竞争分子浓度增加，TR-FRET 信号能够按照预期发生变化。这样可以进一步验证体系是否真正能够反映目标生物学相互作用，而不仅仅是产生一个荧光信号。

第四步：样本检测——根据样本条件进行梯度稀释

阳性对照验证通过后，就可以进入真正的样本检测。这一阶段与前面的体系建立有所不同。TR-FRET 体系的检测对象从已经明确浓度和性质的标准蛋白、阳性对照，转变成了实际研究样本。不同样本的基质、目标蛋白浓度以及潜在干扰因素可能存在明显差异，因此通常不能直接采用单一稀释比例进行检测。

更合理的方式，是根据样本类型和预期浓度范围进行梯度稀释。

例如，对于细胞培养上清、血浆或其他复杂样本，可以设置多个稀释倍数，同时检测同一样本在不同稀释条件下的 TR-FRET 信号。通过比较不同稀释倍数下的检测结果，可以判断样本是否处于体系的有效检测范围内，并选择最终用于定量或比较分析的稀释条件。

Tips：如果需要了解更多细节，您可以通过下载并阅读《TR-FRET Toolbox 应用指导手册》获取一份完整的搭建指南！

六、写在最后

从 FRET 到 TR-FRET，技术解决的是如何把分子间的距离变化转化为结果更可信的信号；从 TR-FRET Kit 到 Toolbox，则进一步解决了一个更实际的问题——当研究对象不断变化、新的检测需求不断出现时，您不必停留在少数已经商品化的 TR-FRET 试剂盒上，而可以利用 Toolbox 通用型工具开发出适配自己的 TR-FRET 检测体系。

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ACRO TR-FRET 试剂盒覆盖 ADCC/ADCP 功能评价、抑制剂筛选、抗体筛选以及蛋白定量等多种应用方向。对于已经有明确靶点和检测目的的项目，即用型试剂盒已经将 Donor、Acceptor、反应组分、Buffer 等实验所需全部材料整合在一起，您可按照既定流程开展实验

TR-FRET Toolbox：自主搭建 Assay

面对新靶点、新蛋白互作或个性化 Assay 开发需求，ACRO TR-FRET Toolbox 提供各种 Donor、Acceptor 及配套 Buffer 等通用组件，支持根据蛋白标签和实验设计自由组合，快速搭建并优化 TR-FRET 体系。

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